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包裹在納米顆粒（PNP）中的植物分子（如外泌體樣納米顆粒（ELN））存在于多種食物，并在局部和全身調(diào)節(jié)重要的腸道微生物群活性和宿主生理系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近的研究表明，生姜來(lái)源的ELN （GELN）可以通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腸道乳桿菌的色氨酸代謝來(lái)緩解結(jié)腸炎，而大蒜來(lái)源的ELN優(yōu)先被腸道疣微菌門(mén)攝取，從而有助于逆轉(zhuǎn)糖尿病的胰島素抵抗。鑒于PNP已從多種不同類(lèi)型的可食用植物中鑒定出來(lái)，這些PNP是否以及如何可能被某些人類(lèi)腸道菌群選擇性攝取，并進(jìn)一步發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的多樣性還有待闡明。
2025年2月3日，美國(guó)路易斯維爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院Huang-Ge Zhang團(tuán)隊(duì)在Nat Commun在線(xiàn)發(fā)表題為“Plant-nanoparticles enhance anti-PD-L1 efficacy by shaping human commensal microbiota metabolites”的文章。姜來(lái)源的外泌體樣納米顆粒（GELN），GELN ally – mir159a -3p通過(guò)抑制受體細(xì)菌磷脂酶C （PLC）的表達(dá)和增加二十二碳六烯酸（DHA）的積累來(lái)增強(qiáng)抗pd – l1治療黑色素瘤。
摘要
飲食已成為影響腸道菌群功能的關(guān)鍵因素。然而，膳食成分的復(fù)雜性使其難以預(yù)測(cè)具體結(jié)局。在本研究中，我們通過(guò)人源化小鼠模型研究了植物源納米顆粒（PNP）在癌癥免疫治療的背景下對(duì)腸道微生物群和代謝產(chǎn)物的影響。具體來(lái)說(shuō)，我們發(fā)現(xiàn)姜來(lái)源的外泌體樣納米顆粒（GELN）分別由二半乳糖基二?；视停―GDG）和甘氨酸介導(dǎo)，被毛螺菌科（Lachnospiraceae）和乳桿菌科（Lactobacillaceae）優(yōu)先攝取。我們進(jìn)一步證明，GELN ally – mir159a -3p通過(guò)抑制受體細(xì)菌磷脂酶C （PLC）的表達(dá)和增加二十二碳六烯酸（DHA）的積累來(lái)增強(qiáng)抗pd – l1治療黑色素瘤。循環(huán)中DHA水平的增加通過(guò)結(jié)合PD-L1啟動(dòng)子抑制腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，并隨后阻止c-myc啟動(dòng)的PD-L1轉(zhuǎn)錄。與對(duì)照組相比，補(bǔ)充DHA的抗pd – l1無(wú)應(yīng)答患者腸道細(xì)菌的無(wú)菌雄性小鼠定植可增強(qiáng)抗pd – l1治療的療效。我們的研究結(jié)果揭示了PNP通過(guò)調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌代謝途徑對(duì)人類(lèi)腫瘤免疫治療的一個(gè)以前未知的機(jī)制影響。
1.植物源性納米粒子（PNP）優(yōu)先被特定的人類(lèi)腸道細(xì)菌家族攝取
食物在通過(guò)腸道時(shí)被消化，并釋放納米大小的顆粒到腸腔。與在腸道中穩(wěn)定存在的外泌體一樣，發(fā)表的結(jié)果表明，植物源性外泌體樣納米顆粒（ELN）對(duì)胃腸道酸性環(huán)境、酶和膽汁提取物表現(xiàn)出高耐受性?？墒秤眉{米顆粒的貨物可能通過(guò)從腸腔轉(zhuǎn)移到體循環(huán)的方式在局部腸道環(huán)境或遠(yuǎn)處組織中發(fā)揮生物活性。本研究主要研究了可食用植物源納米顆粒（PNP）對(duì)人體腸道微生物群落生物學(xué)功能的影響。作為概念的證明，基于文獻(xiàn)報(bào)道，PNP可以從生姜根，大蒜，蘆薈和檸檬中分離，我們開(kāi)始對(duì)從這四種植物中選擇的PNP進(jìn)行表征。使用差速離心法從生姜根、大蒜、蘆薈和檸檬中提取PNP，并使用蔗糖梯度離心法純化。以10萬(wàn)× g終速度離心分離ELN。隨后，我們研究了10000 × g和100000 × g離心獲得的微球中的PNP的特性，分別被稱(chēng)為納米顆粒/ 10000 × g （Nano10）和外泌體樣納米顆粒/ 100000 × g （ELN）。在本研究中，包括ELNs和Nano10在內(nèi)的每一種PNP都是在蔗糖梯度離心后從優(yōu)勢(shì)條帶中純化和收集的。通過(guò)光散射分析測(cè)量的每種PNP的產(chǎn)量表明，食用植物可以作為大規(guī)模生產(chǎn)ELN和Nano10的來(lái)源，特別是葡萄柚和生姜，它們提供了更高的ELN和Nano10的產(chǎn)量。檸檬的PNP產(chǎn)量最低。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明食用植物中至少含有兩種不同特征的PNP （Nano10， ELN）。我們從小鼠腸道微生物中獲得了支持飲食在調(diào)節(jié)腸道微生物群組成和功能方面發(fā)揮作用的許多證據(jù)。然而，小鼠腸道菌群的組成與人類(lèi)腸道菌群的組成不同。為了確定人類(lèi)腸道細(xì)菌是否具有PNP，在知情同意的情況下，收集了15名健康受試者（25 ~ 52歲）的糞便樣本。隨后將細(xì)菌分離并混合在一起，以避免細(xì)菌種類(lèi)的潛在變異。將人糞便細(xì)菌（hFB）等分物定植到無(wú)菌（GF） C57BL/6 J小鼠（hFB小鼠）（圖1A）。
接下來(lái)，為了確定PNP是否優(yōu)先被特定的腸道細(xì)菌家族攝取，我們將PKH26+標(biāo)記的PNP經(jīng)口灌胃給hFB小鼠，然后使用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）對(duì)PNP/PKH26+細(xì)菌進(jìn)行分選（圖1A）。隨后，通過(guò)16S rRNA二代測(cè)序分析了體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中PNP/PKH26+細(xì)菌的組成（圖1A， B）。通過(guò)序列優(yōu)化和質(zhì)量篩選，每個(gè)樣本可獲得102 ~ 185 k的細(xì)菌16S rRNA基因清潔標(biāo)簽。在相似性截?cái)嘀禐?.03（97%）時(shí)，一個(gè)包含36 k 16S rRNA清潔標(biāo)簽的子樣本給出了615個(gè)可操作分類(lèi)單元（OTU）。利用基本局部比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）將16S序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在各分類(lèi)水平上可分為37個(gè)門(mén)、65個(gè)綱、115個(gè)目、192個(gè)科、352個(gè)屬和其他未鑒定的類(lèi)群。比較體內(nèi)和體外PNPs/PKH26+細(xì)菌的組成，我們的數(shù)據(jù)表明，體外PNPs/PKH26+細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)科為毛螺菌科（21.48%±5.38%），擬桿菌科（13.01%±2.40%），Coriobacteriaceae（6.99%±2.67%）和瘤胃球菌科（4.92%±2.01%）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為S24.7(32.43%±11.33%，LI；21.87%±14.12%,SI), Lachnospiraceae(8.25%±4.62%,LI;6.11%±4.29%,SI)和Ruminococcaceae(5.07%±2.47%,LI;4.70%±2.97%，SI)，無(wú)論來(lái)自SI還是LI（圖1B）。有趣的是，反芻動(dòng)物對(duì)PNPs的攝取在體外和體內(nèi)沒(méi)有差異。綜上所述，這些結(jié)果表明，PNP可以被腸道細(xì)菌攝取，除了瘤胃球菌科外，環(huán)境（體外和體內(nèi)）對(duì)PNP的攝取選擇性有影響。此外，我們發(fā)現(xiàn)攝取效率取決于PNP的類(lèi)型（ELN vs . Nano10）和用于分離PNP的植物類(lèi)型（圖1B）。
然后，我們研究了PNP是否被密切相關(guān)的腸道細(xì)菌家族攝取。我們進(jìn)行了主成分分析（PCA），以探索在選擇的PNP和腸道中不同位置的PNP受體細(xì)菌組成的變化（圖1C）。PCA雙標(biāo)圖沿前兩個(gè)主成分捕獲了細(xì)菌組成內(nèi)的大部分方差。主成分1 （PC1）解釋了39.2%的方差，而主成分2 （PC2）解釋了額外的20.5%的方差，累計(jì)覆蓋了數(shù)據(jù)總變異的59%以上（圖1C）。多變量統(tǒng)計(jì)PCA分析顯示，根據(jù)細(xì)菌成分（即彼此接近的細(xì)菌成分），有3個(gè)聚類(lèi)（圖1C）。簇1包括大蒜的ELN和Nano10，姜的Nano10和蘆薈的ELN，它們優(yōu)先被LI中相關(guān)的相似細(xì)菌攝取。簇2包括蘆薈和生姜來(lái)源的PNP，它們?cè)赟I中共享相似的受體細(xì)菌。在Cluster 3中，相似的腸道細(xì)菌在LI中優(yōu)先吸收姜和檸檬來(lái)源的ELN，在SI中也優(yōu)先吸收檸檬來(lái)源的ELN。為了測(cè)試細(xì)菌環(huán)境對(duì)PNP攝取的影響，我們應(yīng)用主坐標(biāo)分析（PCoA）在家族水平上對(duì)otu的UniFrac距離進(jìn)行分析，分為體外（人類(lèi)LI）和體內(nèi)（小鼠LI和SI）。我們的分析表明，樣品之間的距離主要由PCoA1和PCoA2決定（圖1D）。統(tǒng)計(jì)分析表明，主成分1 （28.58%,p = 0.0001）和主成分2 （12.51%,p = 0.002）在這三種情況之間有顯著差異。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，膳食來(lái)源的PNP可以被人類(lèi)腸道細(xì)菌選擇性攝取，并且多種因素影響細(xì)菌攝取PNP，包括PNP的類(lèi)型（Nano10， ELN）、用于分離PNP的植物類(lèi)型和腸道微環(huán)境。
圖1：人體腸道細(xì)菌對(duì)植物來(lái)源的納米顆粒（PNP）的攝取
2.PNP脂質(zhì)和氨基酸充當(dāng)人類(lèi)腸道細(xì)菌的“吃我”/“不要吃我”信號(hào)
飲食通過(guò)多種功能性納米顆粒在調(diào)節(jié)腸道微生物群穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用36,37。新興研究和我們的數(shù)據(jù)（圖1）提示，可食用PNP可被腸道細(xì)菌通過(guò)吞噬途徑選擇性攝取，而PNP衍生因子（如脂質(zhì)和氨基酸[AA]）對(duì)腸道細(xì)菌攝取納米顆粒以調(diào)節(jié)腸道微生物群穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生正面或負(fù)面影響。此外，我們還闡明了PNP如何通過(guò)“吃我” / “不要吃我”信號(hào)被腸道細(xì)菌選擇性攝取的分子機(jī)制。我們之前的研究表明，在小鼠腸道中，乳酸桿菌科優(yōu)先被GELN攝取，這歸因于GELN4中高度富集的磷脂酸（PA）。然而，一般而言，PNP脂質(zhì)是否在腸道細(xì)菌的選擇性攝取中發(fā)揮致病作用尚不清楚。為了確定PNP的脂質(zhì)作用，我們使用三重四極桿質(zhì)譜（MS）進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，確定了從補(bǔ)充表6中列出的PNP提取的脂質(zhì)和脂質(zhì)組成。我們列出了從4種不同類(lèi)型的植物中分離出的ELN和Nano10的組成（圖2a）。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)和小提琴分析表明，ELN和Nano10之間的脂質(zhì)組成存在顯著差異（p = 1e-09），具體來(lái)說(shuō)，PA在ELN中富集，而溶磷脂酰甘油（lysoPG）和二半乳糖基二?；视停―GDG）在Nano10中富集，而與PNP衍生的植物類(lèi)型無(wú)關(guān)（圖2B）。脂質(zhì)譜的PCA圖進(jìn)一步揭示了大蒜PNP和檸檬PNP的整體脂質(zhì)成分更相似，因?yàn)榕c其他類(lèi)型植物的PNP相比，它們?cè)赑CA圖上更接近（圖2C）。相比之下，生姜、蘆薈和大蒜中eln衍生的脂質(zhì)的組成與它們的Nano10不同，這表明了更多的變異（圖2C）。
接下來(lái)，我們確定了PNP衍生因子是否可以作為“吃我”/“不要吃我”的信號(hào)，使PNP被腸道細(xì)菌選擇性攝取。我們發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，富含pa的生姜ELN有助于乳酸桿菌的吸收。然而，雖然AELN具有高水平的PA（圖2A），但乳桿菌科卻只占據(jù)了很少的蘆薈- eln（圖1B），這表明PNP中的多個(gè)因素可能作為介導(dǎo)腸道細(xì)菌攝取的信號(hào)。鑒于納米顆粒膜由多種功能因子組成，包括脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)/AAs，并且發(fā)現(xiàn)aa被細(xì)菌選擇性攝取，我們假設(shè)除了脂質(zhì)外，PNP膜上的aa也作為“吃我”/“不吃我”信號(hào)。為了闡明我們的假設(shè)，我們首先使用MS分析評(píng)估了PNP膜上所有20個(gè)aa的組成。我們發(fā)現(xiàn)，與其他AAs相比，PNP膜上的組氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、精氨酸和脯氨酸水平較高（圖2d）。與Nano10相比，ELN膜上的AAs水平總體較高。具體來(lái)說(shuō)，GELN和姜納米10含有相對(duì)較高水平的甘氨酸，而大蒜PNP含有相對(duì)較高水平的苯丙氨酸和半胱氨酸（圖2D）。采用主成分分析（PCA）探討不同PNPs間aa成分的差異。PCA雙標(biāo)圖（圖2E）沿著前兩個(gè)主成分捕獲了AAs輪廓中80%以上的方差。主成分1 （PC1）解釋了62.9%的方差，而主成分2 （PC2）解釋了額外的20%的方差。來(lái)自檸檬、蘆薈和生姜的Nano10具有共同的aa分布，因?yàn)樗鼈冊(cè)赑CA圖上相互靠近。只有蘆薈在其ELN和Nano10上具有類(lèi)似的AAs組成（圖2E）。
圖2:PNP脂質(zhì)和氨基酸組成分析
采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析PNP中脂質(zhì)和aa的相對(duì)組成與細(xì)菌攝取的相關(guān)性，探討PNP中脂質(zhì)和aa是否可以作為“吃我” / “不吃我”的信號(hào)來(lái)促進(jìn)/阻止腸道細(xì)菌攝取。我們使用K-Means聚類(lèi)方法42的聚類(lèi)熱圖來(lái)顯示不同腸道位置（圖3A）和綜合多個(gè)位置的相關(guān)系數(shù)與這些相關(guān)性的模式。紅色和藍(lán)色分別表示各腸道細(xì)菌分類(lèi)科與PNP脂質(zhì)/ aa含量的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)系數(shù)。生成了火山圖（圖3B， C），以顯示關(guān)聯(lián)相對(duì)于相關(guān)系數(shù)的統(tǒng)計(jì)顯著性。這些圖作為PNP脂質(zhì)（圖3B）/PNP aa（圖3C）和細(xì)菌豐度之間相關(guān)性的可視化表示。使用0.05的p值閾值對(duì)火山圖進(jìn)行分層，以突出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。除了圖表（圖3B， C），我們還列出了基于p值排序的前10個(gè)相關(guān)性（圖3B， C），例如，富含脂質(zhì)單半乳糖基二?；视停∕GDG）的PNP作為“吃我”信號(hào)，用于乳桿菌優(yōu)先攝取，而富含磷脂酰肌醇（PI）的PNP作為“不要吃我”信號(hào)，用于阻止乳桿菌攝取。乳桿菌科也優(yōu)先攝取富含甘氨酸的PNP，而纈氨酸可抑制Ruminococcaceae和Lachnospirascease對(duì)PNP的攝取。
為了驗(yàn)證我們的相關(guān)性分析，表明PNP的脂質(zhì)可以增強(qiáng)/抑制腸道細(xì)菌的攝取，我們用特定種類(lèi)的細(xì)菌進(jìn)行了攝取試驗(yàn)。由于特定種類(lèi)的細(xì)菌可在市場(chǎng)上獲得，我們使用了產(chǎn)氣莢膜梭菌（C. perf） （Lachnospirascease家族的一種）和羅伊乳桿菌（L. reuteri）（乳桿菌科的一種）來(lái)測(cè)試我們的脂質(zhì)相關(guān)性結(jié)果。我們隨機(jī)選取了DGDG（“吃我”）和PI（“不要吃我”），因?yàn)長(zhǎng)achnospirascease家族優(yōu)先攝取DGDG富集的GELN，而PI富集的AELN抑制乳桿菌科對(duì)AELN的攝取（圖3A-C）。為了測(cè)試PNP脂質(zhì)是否介導(dǎo)細(xì)菌的攝取，我們分別從GELN和AELN的總脂質(zhì)中去除DGDG和PI 4，剩余的脂質(zhì)通過(guò)超聲處理重新組裝成納米大小的納米囊泡（NV），分別稱(chēng)為姜NV（GNV）和蘆薈NV（ANV）。FACS分析表明，受體細(xì)菌對(duì)GELN和GNV、AELN和ANV的攝取效率相似（圖3D）。此外，從GNV脂質(zhì)中去除DGDG顯著降低了穿孔念珠菌對(duì)GNV的攝取，而添加DGDG則恢復(fù)了對(duì)GNV的攝取（圖3D，左面板）。相反，PI的消耗促進(jìn)了L. reuteri對(duì)ANV的攝取，而PI的添加恢復(fù)了對(duì)ANV攝取的抑制作用（圖3D，右圖）。
為了驗(yàn)證AAs對(duì)PNP是否具有促進(jìn)/抑制腸道細(xì)菌攝取的作用，我們對(duì)特定種類(lèi)的細(xì)菌進(jìn)行了攝取實(shí)驗(yàn)。由于特定種類(lèi)的細(xì)菌，乳桿菌科的一種羅伊乳桿菌（L. reuteri）和瘤胃球菌科的一種bromii瘤胃球菌（R. bromii）被用于檢驗(yàn)我們的aa相關(guān)性結(jié)果。我們隨機(jī)選取了甘氨酸（“吃我”）和纈氨酸（“不要吃我”），因?yàn)镚ELN甘氨酸促進(jìn)乳桿菌科對(duì)GELN的攝取，纈氨酸抑制瘤胃球菌科對(duì)GELN的攝?。▓D3A-C）。為了證實(shí)我們的AAs相關(guān)性結(jié)果，我們分別用甘氨酸和纈氨酸預(yù)孵育羅伊氏乳桿菌和溴代雷氏乳桿菌。FACS分析表明，預(yù)孵育游離形式的甘氨酸抑制羅伊氏乳桿菌對(duì)GELN的攝取，而預(yù)孵育游離形式的纈氨酸促進(jìn)溴代雷氏乳桿菌對(duì)GELN的攝?。▓D3E，左圖）。用甘氨酸脫氫酶（GLDC）從GELN中去除甘氨酸可減少羅伊氏乳桿菌對(duì)GELN的攝取，而用纈氨酸脫氫酶（VDH）從GELN中去除纈氨酸可誘導(dǎo)溴代雷公藤對(duì)GELN的攝?。▓D3E，右）。這些結(jié)果也與相關(guān)分析一致，提示pnp衍生的多種因素，包括脂質(zhì)和AA，可以作為“吃我”/“不要吃我”的信號(hào)，以增強(qiáng)/抑制人體腸道細(xì)菌的攝取。不同類(lèi)型的食用植物含有多種PNP，且每種PNP都有其獨(dú)特的脂質(zhì)和aa組成，我們的數(shù)據(jù)表明，PNP上特定的脂質(zhì)和aa譜可以通過(guò)選擇性地增強(qiáng)/抑制腸道細(xì)菌對(duì)PNP的攝取來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。
圖3：腸道細(xì)菌優(yōu)先攝取與PNP脂質(zhì)和氨基酸組成的相關(guān)性分析
3.PNP通過(guò)改變?nèi)梭w腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝途徑
為了專(zhuān)注于細(xì)菌代謝物并排除宿主代謝物的影響，GF小鼠的LC-MS/MS數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后代表了細(xì)菌代謝物的改變。熱圖分析顯示，PNP調(diào)節(jié)了上調(diào)和下調(diào)的腸道細(xì)菌代謝物。數(shù)據(jù)表明，來(lái)自生姜（圖4A）、大蒜（圖4B）、蘆薈（圖4C）和檸檬（圖4D）的PNP對(duì)細(xì)菌代謝產(chǎn)物水平的影響取決于PNP的類(lèi)型和腸道微環(huán)境。例如，來(lái)自同一類(lèi)型植物的ELN和Nano10具有不同的作用。氨基丁酸（GABA）在eln處理的腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物中高度富集，但在nano10處理的細(xì)菌中沒(méi)有。在SI中，GELN顯著誘導(dǎo)了腸道細(xì)菌來(lái)源的不飽和脂肪酸（USF），包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），但在LI中沒(méi)有，也沒(méi)有被Nano10或其他植物來(lái)源的PNP誘導(dǎo)（圖4A）。這一結(jié)果表明，腸道微環(huán)境影響PNP介導(dǎo)的對(duì)人體腸道菌群代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。
圖4：通過(guò)代謝組學(xué)分析PNP對(duì)腸道細(xì)菌代謝物的影響
接下來(lái)，我們?cè)噲D訪(fǎng)問(wèn)基于人類(lèi)代謝的通路，這些通路可能受到PNP調(diào)節(jié)的人類(lèi)腸道細(xì)菌衍生代謝物的調(diào)節(jié)。為了確定哪些代謝通路在ELN和Nano10處理后發(fā)生了改變，我們使用了KEGG代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。利用最新的KEGG代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌的166個(gè)差異代謝物受到ELN和Nano10的影響，并與人類(lèi)代謝通路相關(guān)。代謝通路在散點(diǎn)圖中可視化（圖5A）。代謝途徑的相對(duì)影響通過(guò)代謝途徑中所有代謝物的變化倍數(shù)來(lái)估計(jì)，如圖5A所示。更具體地說(shuō)，結(jié)果表明，LI的代謝產(chǎn)物對(duì)ELN處理的丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸（AAG）途徑有顯著影響，而三羧酸（TCA）循環(huán)途徑受到Nano10的影響，無(wú)論植物類(lèi)型。有趣的是，在SI中，AAG和TCA通路都受到姜和大蒜來(lái)源的PNP的高度影響。然而，蘆薈ELN和檸檬ELN分別對(duì)TCA和AAG通路沒(méi)有影響，而生姜ELN在SI中顯著上調(diào)USF通路。熱圖（圖5B）表明，d -谷氨酰胺和d -谷氨酸（DGG）、精氨酸和脯氨酸（ARP）以及?；撬岷痛闻；撬幔═HT）途徑的活性被所有4種ELNs增強(qiáng)，而這些途徑的活性被所有4種Nano10消除。相反，四種eln均可降低谷胱甘肽（GTA）活性，而四種Nano10均可提高GTA活性。這種變化不可能是由于用于治療hFB小鼠的納米粒子的量的變化，因?yàn)闊o(wú)論哪種類(lèi)型的納米粒子用于治療小鼠，在ANS， ASC和GPL活性方面沒(méi)有差異。此外，我們注意到，PNP處理后，生物素代謝（BIO）通路僅在小鼠的LI中發(fā)生改變，而包括BAL、AAT、MTB、USF、HIT和PTG在內(nèi)的多條通路在SI中發(fā)生改變（圖5B）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，ELN和Nano10可能通過(guò)作用于腸道細(xì)菌釋放的代謝物來(lái)調(diào)節(jié)人體代謝通路的穩(wěn)態(tài)，如DGG和THT通路。
圖5:pnp介導(dǎo)的細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)宿主代謝通路的影響
4.在小鼠模型中，GELN rna通過(guò)抑制黑色素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌代謝活性
接下來(lái)，我們確定了通過(guò)PNP塑造腸道細(xì)菌代謝物是否有利于治療與生態(tài)失調(diào)相關(guān)的疾病。由于患者微生物組的異質(zhì)性，免疫治療僅使一部分患者獲益，因此我們利用抗黑色素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-L1進(jìn)一步檢驗(yàn)了我們的假設(shè)，即PNP可增強(qiáng)靶向腸道微生物組的PNP介導(dǎo)的基于抗PD-L1的免疫治療。hFB定植的雄性小鼠經(jīng)口灌胃給予PNP 1個(gè)月，然后從糞便上清液中收集腸道代謝物（PNP- sup）。將B16F10黑色素瘤細(xì)胞皮下注射到hFB小鼠體內(nèi)。接種7天后，我們通過(guò)腹腔（IP）注射方式將抗pd – l1 mAb （Bioxcell BE0101, 10 mg/kg，體重）以及PNP或PNP- sup給藥至攜帶黑色素瘤B16F10的小鼠（圖6A）。我們發(fā)現(xiàn)，生姜來(lái)源的ELN （GELN）或GELN- sup顯著增強(qiáng)了抗pd – l1治療對(duì)B16F10黑色素瘤生長(zhǎng)（圖6B，頂部圖）和肺轉(zhuǎn)移（圖6B，底部圖）的抑制作用。
鑒于小rna在ELN中占主導(dǎo)地位，我們使用了一個(gè)無(wú)序的miRNA作為對(duì)照。我們的結(jié)果表明，GNV-RNA和GNV-RNA喂養(yǎng)的hFB小鼠的腸道代謝物（GNV-RNA -sup）在增強(qiáng)抗pd – l1介導(dǎo)的抗B16F10黑色素瘤進(jìn)展效應(yīng)方面表現(xiàn)出相似的作用（圖6C）。沒(méi)有證據(jù)表明gnv – rna增強(qiáng)了抗pd – l1介導(dǎo)的抗B16F10黑色素瘤治療，但喂食無(wú)特定病原體（SPF） hFB小鼠的gnv – rna產(chǎn)生的腸道代謝物恢復(fù)了gnv – rna介導(dǎo)的抗pd – l1治療增強(qiáng)對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移的活性（圖6D）。比較研究提示GNV-RNAs可改善抗pd – l1治療對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的療效（圖6E），并延長(zhǎng)hFB小鼠的生存期（圖6F），但對(duì)GF小鼠無(wú)影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明GNV-RNA通過(guò)腸道微生物代謝物增強(qiáng)PD-L1免疫治療對(duì)抗黑色素瘤進(jìn)展。
圖6：姜- eln （GELN）通過(guò)腸道代謝物提高抗黑色素瘤PD-L1抗體的效果
5.GELN aly-miR159a-3p靶向細(xì)菌磷脂酶C （PLC）導(dǎo)致DHA蓄積
在LC-MS/MS分析中觀察到在geln處理的hFB小鼠的SI中顯著誘導(dǎo)EPA及其代謝產(chǎn)物DHA，而在GF小鼠中未觀察到這一事實(shí)（圖4A），進(jìn)一步促使我們研究不飽和脂肪酸EPA和DHA是否有助于GELN-RNA增強(qiáng)抗pd – l1免疫治療的分子機(jī)制。采用個(gè)體高效液相色譜法（HPLC）對(duì)LC-MS分析進(jìn)行驗(yàn)證。正如預(yù)期的那樣，EPA和DHA是由GELN特異性誘導(dǎo)的，而不是其他PNP。這一結(jié)果在hFB小鼠中再現(xiàn)，但在GF小鼠中未再現(xiàn)（圖7A）。HPLC分析還表明，被包裹到GNV中的GELN-RNA （GNV- rna）在hFB小鼠腸道中顯著誘導(dǎo)了DHA和EPA，但在GF小鼠腸道中沒(méi)有（圖7B）。相比之下，來(lái)自大蒜、蘆薈和檸檬的NV-RNA混合物（NV-RNAMix）對(duì)腸道糞便和外周血中的EPA和DHA無(wú)影響（圖7）。鑒于Lachnospirascease是由GELN的DGDG介導(dǎo)的GELN的主要靶向細(xì)菌之一（圖1A）（圖3D），我們利用Lachnospirascease家族中的一種c.p erf來(lái)檢驗(yàn)我們的假設(shè)，即lachnospirasase對(duì)GELN- rna的攝取導(dǎo)致EPA和DHA的誘導(dǎo)，從而有助于增強(qiáng)抗pd – l1免疫治療。用高效液相色譜法測(cè)定了穿孔C. perf培養(yǎng)基中DHA和EPA的含量。我們發(fā)現(xiàn)DHA和EPA是由GNV-RNA而不是NV-RNAMix誘導(dǎo)的（圖7B）。接下來(lái)，我們?cè)噲D確定GELN-RNA誘導(dǎo)DHA和EPA產(chǎn)生的潛在機(jī)制。利用我們之前在NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)表的GELN- rna測(cè)序數(shù)據(jù)（accession, GSE153126），將高豐度的GELN- rna mirna序列（圖7C）從NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/bacteria/）輸入細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索GELN mirna的潛在靶點(diǎn)。利用BLAST對(duì)核苷酸序列進(jìn)行的比對(duì)表明，GELN miRNA aly-miR159a-3p可能通過(guò)兩個(gè)7-mer長(zhǎng)度的反向補(bǔ)體序列靶向磷脂酶C (PLC)（圖7D），這些反向補(bǔ)體序列包含一個(gè)可能催化DHA生成4-oxo-DHA和4-HDHA46,47)（圖7E）。為了進(jìn)一步闡明GELN ally – mir159a是否抑制梭狀芽孢桿菌目中PLC的表達(dá)，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)也表明，PLC DNA可以被aly-miR159a-3p C. perf（圖7F，左圖）和小鼠糞便（圖7F，右圖）拉下，但不能被aly-miR159a-3p突變體拉下。對(duì)經(jīng)aly-miR159a-3p處理的c.p erf進(jìn)行的qPCR（圖7G）和western blot（圖7H）分析表明，PLC編碼基因的表達(dá)確實(shí)分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平受到抑制。對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)基的HPLC分析表明，aly-miR159a處理導(dǎo)致DHA誘導(dǎo)和4-oxo-DHA減少，但對(duì)EPA無(wú)影響（圖7I）。GELN aly-miR159a-3p可抑制PLC的表達(dá)。PLC可以代謝DHA為4-oxo-DHA，因此，抑制PLC的表達(dá)導(dǎo)致DHA在穿孔C. perf中累積（圖7E）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PLC對(duì)DHA代謝的作用，我們從穿孔C. perf基因組中敲除了編碼PLC的基因（KO）（圖7J），并使用融合pcr驅(qū)動(dòng)的重疊延伸（overlap extension48,49）替換為氨芐西林耐藥序列。PLC KO導(dǎo)致穿孔C. perf中DHA水平顯著增加，4-oxo-DHA水平顯著降低（圖7K）。在PLC缺陷的C. perf中，aly-miR-159a-3p不再影響DHA和4-oxo-DHA水平（圖7K）。
圖7：富集了aly-miR159a-3p的geln通過(guò)靶向PLC調(diào)控細(xì)菌中DHA的代謝
6.DHA增強(qiáng)黑色素瘤抗pd – l1免疫治療的療效
為了進(jìn)一步確定DHA是否在增強(qiáng)抗PD-L1治療對(duì)抗黑色素瘤進(jìn)展中發(fā)揮致病作用，B16F10黑色素瘤荷瘤小鼠接受了1個(gè)月的PD-L1 Ab（含/不含DHA或EPA）治療。結(jié)果表明，DHA和EPA均提高了PD-L1 Ab對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)（圖8A，頂部圖）和肺轉(zhuǎn)移（圖8A，底部圖）的效果，并延長(zhǎng)了小鼠的生存期（圖8B）。通過(guò)qPCR（圖8C）和western blot（圖8D）分析腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)這兩種代謝物分別在mRNA和蛋白水平上抑制PD-L1的表達(dá)。暴露于DHA的B16F10細(xì)胞以DHA劑量依賴(lài)性方式導(dǎo)致PD-L1表達(dá)降低（圖8E）。
圖8:DHA通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)來(lái)提高抗黑色素瘤的PD-L1抗體的有效性
鑒于DHA抑制PD-L1表達(dá)，并且PD-L1水平代表了抗PD-L1免疫治療應(yīng)答的潛在生物標(biāo)志物，我們下一步研究臨床腫瘤樣本中的DHA和PD-L1水平是否與治療應(yīng)答相關(guān)。對(duì)61例福爾馬林固定石蠟包埋的黑素瘤存檔標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)進(jìn)行分析，其中PD-L1反應(yīng)組35例，PD-L1無(wú)反應(yīng)組26例。行PD-L1免疫組織化學(xué)（IHC）后，對(duì)每例標(biāo)本進(jìn)行掃描，并采用計(jì)算機(jī)輔助方法對(duì)PD-L1表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，黑色素瘤組織中PD-L1信號(hào)的強(qiáng)度（圖9A，左側(cè)IHC面板）和PD-L1+細(xì)胞的百分比（圖9A，右側(cè)條形圖面板）明顯增加，免疫治療無(wú)應(yīng)答患者的腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)高于應(yīng)答患者的腫瘤組織。為了進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，我們采用定量方法評(píng)估了樣本中PD-L1的表達(dá)。qPCR（圖9B）、ELISA（圖9C）和免疫印跡（圖9D）的結(jié)果一致表明，與有應(yīng)答的腫瘤相比，無(wú)應(yīng)答的腫瘤表現(xiàn)出更高的PD-L1水平，無(wú)應(yīng)答的腫瘤組織有更多的PD-L1 mRNA和蛋白。相反，HPLC分析表明，與鄰近的非腫瘤組織相比，腫瘤中的DHA降低，并且與治療有效的黑色素瘤患者相比，治療無(wú)效患者腫瘤中的DHA降低（圖9E）。受試者的腸道中也發(fā)現(xiàn)了DHA的這種減少（圖9F）。PD-L1與DHA呈負(fù)相關(guān)（R2 = 0.86 ~ 0.97）。
為了評(píng)估人類(lèi)腸道細(xì)菌在免疫治療應(yīng)答中的作用，我們從對(duì)PD-L1治療有應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答的受試者中分離出腸道細(xì)菌。PLC是DHA代謝成4-oxo-DHA所必需的，而4-oxo-DHA有助于癌癥的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)qPCR測(cè)定PLC的表達(dá)，并表明來(lái)自無(wú)應(yīng)答受試者的細(xì)菌中的PLC高于來(lái)自應(yīng)答受試者的細(xì)菌（圖9G）。然后，將應(yīng)答和無(wú)應(yīng)答受試者的細(xì)菌定植于GF小鼠（圖9H）。我們發(fā)現(xiàn)，來(lái)自應(yīng)答受試者的共生細(xì)菌（BacResp），而非來(lái)自無(wú)應(yīng)答受試者的共生細(xì)菌（BacNon），通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖9I，頂部圖）和肺轉(zhuǎn)移（圖9I，底部圖），以及延長(zhǎng)小鼠生存期（圖9J），顯著改善了抗pd – l1免疫治療。BacNon提供的DHA和BacResp同樣可以提高免疫治療的效率，這進(jìn)一步表明腸道細(xì)菌的DHA通過(guò)DHA介導(dǎo)的抑制腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)在提高抗PD-L1免疫治療中起著致病作用?？紤]到PD-L1與PD-1的結(jié)合會(huì)干擾T細(xì)胞（尤其是CD8+亞群）的抗腫瘤應(yīng)答和增殖，我們接下來(lái)評(píng)估了CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中的腫瘤特異性干擾素-γ (IFNγ)水平。在FACS分析中，對(duì)CD8+PD-1+細(xì)胞進(jìn)行了門(mén)控，結(jié)果表明BacResp和DHA均顯著促進(jìn)CD8+PD-1+ T細(xì)胞的IFNγ生成（圖9K），并減少細(xì)胞凋亡（Annexin V+7-AAD -）（圖9L），而B(niǎo)acNon無(wú)此作用。鑒于天然的和經(jīng)過(guò)工程改造的PNPs通常被局部免疫細(xì)胞（如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）攝取，我們測(cè)試了GELNs是否靶向并影響腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
總之，我們的數(shù)據(jù)提示，抗pd – l1無(wú)應(yīng)答患者的腸道細(xì)菌表現(xiàn)出高水平的PLC活性。高水平的PLC活性又加速了DHA的代謝，促進(jìn)腫瘤中PD-L1的表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞的抗腫瘤活性和生存能力受損。在無(wú)應(yīng)答小鼠中，給予BacResp或DHA可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，并提高抗pd – l1免疫治療的療效。
圖9：在黑色素瘤患者中，PLC的誘導(dǎo)減輕了導(dǎo)致抗pd – l1免疫治療無(wú)應(yīng)答的DHA水平
7.DHA通過(guò)與PD-L1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的表觀遺傳效應(yīng)抑制PD-L1的表達(dá)
非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析后，將12個(gè)DNA寡聚體（PD-L1p1到PD-L1p12，每個(gè)2μM）與DHA（10μM）孵育（圖10A）。正如預(yù)期的那樣，SSGS檢測(cè)表明，只有寡聚PD-L1p9 （TSS上游- 380 ~ – 321）的遷移率被DHA而非EPA改變（圖10B），這表明DHA而非EPA與PD-L1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。為了確定DHA與PD-1L啟動(dòng)子的準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)，我們使用覆蓋PD-L1p9全序列的短寡核苷酸（PD-L1p9A到PD-L1p9F，每個(gè)20 mer）和每個(gè)寡核苷酸的重疊序列來(lái)測(cè)試遷移率的變化。只有寡聚體PD-L1p9C發(fā)生了位移（圖10C），這表明PD-L1p9C的序列包含一個(gè)潛在的與代謝產(chǎn)物DHA結(jié)合的必要序列。來(lái)自hFB定植小鼠的腸道上清，以及來(lái)自geln處理的小鼠的腸道上清，重新建立了寡核苷酸PD-L1p9C遷移率的改變（圖10D）。寡核苷酸PD-L1p9C的突變消除了遷移率的改變（圖10D）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DHA和寡聚體PD-L1p9C的動(dòng)態(tài)相互作用，我們接下來(lái)進(jìn)行了表面等離子體共振（SPR）分析，這是一種檢測(cè)兩種不同分子相互作用的光學(xué)技術(shù)。在該技術(shù)中，生物素標(biāo)記的寡聚體被固定在鏈親和素傳感器芯片上，而DHA通過(guò)SPR儀器的流式細(xì)胞儀進(jìn)行接觸。SPR檢測(cè)結(jié)果表明，DHA與生物素標(biāo)記的（Bio-） PD-L1p9C結(jié)合，但不與突變的（Bio-） PD-L1p9C （PD-L1p9C- mut）結(jié)合（圖10E）。這一結(jié)果與SSGS檢測(cè)結(jié)果一致。為了進(jìn)一步確定DHA與PD-L1啟動(dòng)子的結(jié)合是否會(huì)改變PD-L1啟動(dòng)子的活性，我們將小鼠PD-L1啟動(dòng)子序列引入Gaussia熒光素酶報(bào)告基因（pEZX-mPDL1, GeneCopoeia）。以DHA結(jié)合序列修飾的突變體（pEZX-mPDL1-Mut）作為對(duì)照。熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，DHA抑制轉(zhuǎn)染pEZX-mPDL1的細(xì)胞的熒光素酶活性，但不抑制突變體（圖10F）。為了進(jìn)一步揭示DHA結(jié)合所需的特定DNA基序，我們合成了20 mer長(zhǎng)度的含有潛在DHA結(jié)合基序的DNA寡核苷酸。在20個(gè)寡核苷酸中，每個(gè)寡核苷酸含有1個(gè)突變堿基。我們假設(shè)，如果必需堿基被取代，寡核苷酸的DHA結(jié)合活性將降低。正如預(yù)期的那樣，SSGS分析提示，PD-L1 TSS上游的- 341 ~ – 358序列AGCCT……ATCAGC是DHA結(jié)合所必需的（圖10G）。多重序列比對(duì)表明，這一PD-L1結(jié)合基序在人類(lèi)和小鼠中是保守的序列，兩者在PD-L1基因的啟動(dòng)子區(qū)都共享這一共有序列（圖10H）。
更有趣的是，使用PROMO 3.0對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)（http://alggen.lsi.upc.edu）表明，小鼠和人類(lèi)PD-L1啟動(dòng)子在DHA結(jié)合位點(diǎn)附近都有一個(gè)c-myc結(jié)合基序（CCAGGTG）（圖10H）。使用含有小鼠（pEZX-mPDL1）和人（pEZX-hPDL1） PD-L1啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因進(jìn)行的熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，在轉(zhuǎn)染pEZX-mPDL1和pEZX-hPDL1的細(xì)胞中，c-myc缺陷取消了dha介導(dǎo)的熒光素酶活性抑制（圖10I）。重組c-myc與pEZX-mPDL1或pEZX-hPDL1共轉(zhuǎn)染可恢復(fù)DHA抑制活性。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)菌代謝物DHA通過(guò)抑制c-myc介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)誘導(dǎo)，增強(qiáng)抗PD-L1免疫治療的療效。
為了進(jìn)一步確定DHA和PD-L1啟動(dòng)子之間的分子結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)，我們使用Mfold測(cè)試了含有DHA靶向序列的小鼠和人PD-L1啟動(dòng)子序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖10H），然后使用HDOCK服務(wù)器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）分析對(duì)接。利用UCSF Chimera58分析的潛在分子相互作用模式表明，DHA和PD-L1啟動(dòng)子之間通過(guò)G-4 (m)和G-11 (h)位置的氫鍵相互作用，發(fā)生的對(duì)接分?jǐn)?shù)為-39.98，配體rmsd （?）為19.83（圖10J）。對(duì)SPR的進(jìn)一步分析表明，DHA抑制c-myc作為轉(zhuǎn)錄因子募集到PD-L1的啟動(dòng)子（圖10K）。試管實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了DHA與PD-L1啟動(dòng)子區(qū)相互作用的結(jié)果。B16F10黑色素瘤細(xì)胞用腸道上清液和生物素標(biāo)記(Bio)-PD-L1p9C （Bio- wt）或Bio- s100p1 – g突變體（Bio- mutant）處理6小時(shí)，并用鏈霉親和素珠從細(xì)胞裂解液中拉出復(fù)合物，用于定量分析代謝物。LC-MS結(jié)果表明DHA被PD-L1p9C募集到復(fù)合物中，而不是被突變體募集（圖10L）。
綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明DHA通過(guò)表觀遺傳效應(yīng)抑制小鼠和人PD-L1在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。腸道DHA水平和PD-L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)進(jìn)一步證明了DHA增強(qiáng)抗PD-L1治療的生物學(xué)效應(yīng)。
圖10:DHA干擾轉(zhuǎn)錄因子c-myc對(duì)PD-L1啟動(dòng)子的訪(fǎng)問(wèn)
結(jié)論
姜來(lái)源的外泌體樣納米顆粒GELN可以通過(guò)靶向人類(lèi)腸道共生菌群的不飽和脂肪酸代謝通路來(lái)增強(qiáng)黑色素瘤抗pd – l1治療的療效。這一創(chuàng)新策略通過(guò)將天然化合物與先進(jìn)的免疫療法相結(jié)合，為提高癌癥治療效果開(kāi)辟了新的途徑。
Teng Y, Luo C, Qiu X, Mu J, Sriwastva MK, Xu Q, Liu M, Hu X, Xu F, Zhang L, Park JW, Hwang JY, Kong M, Liu Z, Zhang X, Xu R, Yan J, Merchant ML, McClain CJ, Zhang HG. Plant-nanoparticles enhance anti-PD-L1 efficacy by shaping human commensal microbiota metabolites. Nat Commun. 2025 Feb 3;16(1):1295. doi: 10.1038/s41467-025-56498-2.
