3.?葛根素靶向GABRA1抑制DMV

為了闡明介導(dǎo)DMV神經(jīng)元對脂肪吸收的抑制作用的分子機(jī)制，接下來使用葛根素作為誘餌，進(jìn)行了基于活性的蛋白質(zhì)譜分析策略。葛根素標(biāo)簽探針與光反應(yīng)標(biāo)簽合成，通過光親和化學(xué)反應(yīng)富集和可視化目標(biāo)蛋白(圖3a)。驗證了探針標(biāo)記的葛根素與未標(biāo)記的葛根素保持相同的增加糞便脂質(zhì)排泄的效果。將探針標(biāo)記的葛根素添加到新鮮分離的腦干樣本中，并使用10劑未標(biāo)記的葛根素作為探針標(biāo)記的葛根素的競爭劑(方法)。光親和反應(yīng)后，通過液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS /MS)鑒定目標(biāo)蛋白。在571個潛在的靶蛋白中(圖3b)，只有14個候選蛋白屬于膜受體和離子通道。在這14種蛋白質(zhì)中，GABRA1被優(yōu)先考慮為有前景的靶點(diǎn)，因為它在DMV中大量表達(dá)，而在鄰近腦區(qū)中表達(dá)較少(Allen brain Map數(shù)據(jù)庫)。此外，GABAA受體與迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)有關(guān)。通過蛋白質(zhì)印跡法驗證了探針標(biāo)記的葛根素和GABRA1蛋白之間的相互作用(圖3c)。還檢測到探針標(biāo)記的葛根素與DMV區(qū)域PHOX2B-tdTomato神經(jīng)元中的GABRA1高度共定位，并且這些信號可以被10個劑量的非標(biāo)記的葛根素阻斷(圖3d)。

GABAA受體是五聚體配體門控離子通道，是脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)中抑制性神經(jīng)傳遞的主要決定因素。為了研究葛根素對含α1亞基的GABAA受體的作用，使用了α1β3γ2L異五聚體，一個典型的神經(jīng)元亞型。首先，通過全細(xì)胞膜片鉗記錄表達(dá)該受體的HEK293S細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)葛根素放大了gaba誘導(dǎo)電流(圖3e,f)。接下來，我們解決了與葛根素結(jié)合的α1β3γ2L GABAA受體的單粒子低溫電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu)，名義分辨率為2.4 ?(圖3 g)。葛根素密度在α1+/γ2 -界面的C環(huán)下觀察到(圖3 g),一個經(jīng)典的結(jié)合位點(diǎn)對苯二氮卓類和其他細(xì)胞外區(qū)域的變構(gòu)調(diào)節(jié)器對GABAA receptors突觸。在這個口袋里，葛根素的表面積為587 ?2。其羥基苯基指向γ2-C -亞基，色酮和葡萄糖苷主要與α1-D+-亞基結(jié)合。α1Tyr210和γ2Phe77殘基通過π -π疊加作用錨定葛根素色酮核心。除了水介導(dǎo)的接觸外，葛根素結(jié)合還通過一個氫鍵網(wǎng)絡(luò)來穩(wěn)定，該網(wǎng)絡(luò)涉及環(huán)C殘基α1Ser205和α1Thr207，以及α1His102和γ2Asp56(圖3h）。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，連同電生理記錄，表明葛根素作為正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。

為了證實葛根素可以通過DMV GABRA1抑制脂肪吸收，將Gabra1flox/flox (Gabra1fl/fl)小鼠與Phox2b-cre小鼠雜交，產(chǎn)生GABRA1條件性敲除(cKO)小鼠。在沒有Gabra1的情況下，觀察到與對照flox小鼠相比，DMV神經(jīng)元活動增加，體重增加(圖3i,j)，糞便脂肪排泄減少(圖3k,l)和空腸脂肪吸收增加(圖3m)。值得注意的是，在對腦干切片進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄時，葛根素對對照組小鼠的大部分DMV神經(jīng)元(70%，14 / 20)產(chǎn)生抑制作用，但在沒有Gabra1的情況下，葛根素的作用大大降低(19.05%，4 / 21)。此外，Gabra1的缺失消除了葛根素抑制脂肪吸收和體重增加的作用(圖3i-m)。綜上所述，數(shù)據(jù)表明葛根素通過與含有α1亞基的GABAA受體結(jié)合，對dmv -迷走神經(jīng)軸發(fā)揮抑制作用，從而調(diào)節(jié)脂肪吸收。